南通大学袁卉华/杨宇民/李碧云Adv. Sci.：一种仿生自愈导电水凝胶促进周围神经再生！

自愈导电水凝胶的开发对于电活性神经组织工程至关重要。典型的导电材料如聚吡咯(PPy)通常用于制造人工神经导管。此外，组织工程领域已经朝着透明质酸(HA)水凝胶等产品的使用方向发展。尽管HA修饰的PPy薄膜可用于各种生物应用，但细胞-基质相互作用机制仍然知之甚少。此外，还没有关于HA修饰的PPy注射自愈水凝胶用于周围神经修复的报道。因此，在本研究中，南通大学袁卉华/杨宇民/李碧云用HA、胱胺(Cys)和吡咯-1-丙酸(Py-COOH)构建了一种具有可注射性、生物可降解性、生物相容性和神经再生能力的自修复导电水凝胶(HASPy)。该水凝胶直接靶向白细胞介素17受体A(IL-17RA)，主要通过激活白细胞介素17(IL-17)信号通路来促进与雪旺细胞髓鞘形成相关的基因和蛋白质的表达。将水凝胶直接注射到大鼠坐骨神经挤压损伤部位，以研究其体内神经再生的能力，并发现其可促进功能恢复和髓鞘再生。这项研究可能有助于理解细胞-基质相互作用的机制，并为 HASPy 水凝胶作为神经再生先进支架的潜在用途提供新的见解。该研究以题为“A Bioinspired Self-Healing Conductive Hydrogel Promoting Peripheral Nerve Regeneration”的论文发表在《Advanced Science》上。

在本研究中，使用透明质酸钠、半胱胺二盐酸盐(Cys)和吡咯-1-丙酸(Py-COOH)制备了可注射自愈导电水凝胶。受体内二硫键导致多肽链空间结构断裂的启发，该研究引入Cys二硫键来交联HA和Py-COOH；这赋予水凝胶在细胞外基质微环境条件下具有可调的生物降解性。Cys接枝到HA上形成氨基键功能化的HA (HA-Cys)。然后，Py-COOH通过与氨基键反应而接枝到HA-Cys上，形成Py接枝HA (HA-Cys-Py)。最后，通过氯化铁的金属配位键聚合吡咯，显着提高了HASPy水凝胶的力学性能和电导率。

图1|HASPy水凝胶构建及应用示意图

【HASPy水凝胶的理化表征】

图2A显示了HA和HASPy水凝胶的数码照片以及使用扫描电子显微镜(SEM)观察到的微观结构。HA水凝胶的孔不均匀，没有表现出其典型的均匀结构。相反，HASPy水凝胶的多孔结构比例紧密且呈现网络结构。此外，这种水凝胶可以通过带针头的注射器注射。经过反复流变测试后，HASPy水凝胶在1%和400%应变之间的转变行为仍然可以重现。这表明水凝胶具有显着的自修复能力和机械强度。

图2|水凝胶的物理化学表征

HA和HASPy水凝胶的电导率分别为2.6 ± 0.17和7.7 ± 1.5 mS cm−1。重要的是，HASPy水凝胶的电导率高于先前报道的基于HA的自修复导电水凝胶。此外，HASPy水凝胶的阻抗更小。HA和HASPy水凝胶的阻抗分别约为137和66 Ω。为了进一步研究HA和HASPy 水凝胶的电自愈功能，将它们连接到电阻计。即使完全断开，HASPy水凝胶也能自我修复。这表明HASPy水凝胶具有显着的导电性和敏感性，并表明作为坐骨神经替代物对植入具有积极的治疗效果。HASPy水凝胶可以拉伸至其原始长度的大约五倍，表明其具有优异的柔韧性和拉伸能力。而且修复后仍可拉伸至原长度的约4.5倍，表现出优异的自修复性能。此外，HASPy可以替代受损神经并有效恢复次级感觉功能，表明HASPy具有更优化的自我修复性能，其导电性可以恢复，有利于体内神经修复。这些结果表明 HASPy作为体内神经替代物的适用性。

图3|水凝胶的自修复导电性能和HASPy离体水凝胶替代牛蛙坐骨神经

图4说明了HASPy-Water-Fe3+模型中离子改进的分子机制，其中Fe3+离子通过羰基氧结合两条HASPy链，形成多个链连接的Fe键。它还显示出关键的界面行为，其中链连接铁键的断裂导致更高的机械性能。这主要归因于链连接的Fe键限制了HASPy链的断开并促进HASPy链之间形成更多的氢键。且离子对HASPy链的增强作用明显大于水分子。

图4|HASPy水凝胶的分子动力学模拟

【HASPy对雪旺细胞生长及功能基因和蛋白质表达的影响】

为了进一步评估HASPy水凝胶对周围神经中最重要的宿主细胞雪旺细胞的影响，将HASPy 与雪旺细胞共培养3天。结果表明HASPy水凝胶具有良好的细胞相容性，使其成为神经修复的潜在材料。为了分析雪旺细胞生物标志物胶质纤维蛋白S100-β的表达水平，进行了免疫荧光染色。结果显示，HASPy组中S100-β的表达量显着高于TCP和HA组，表明HASPy水凝胶促进了雪旺细胞相关功能蛋白的表达。

为了研究与神经再生相关的基因在水凝胶组中是否受到调节，与髓鞘形成、细胞骨架发育、增殖和施万细胞相关的三个基因，包括髓鞘碱性蛋白(MBP)、神经生长因子(NGF)和施万细胞标记物(S100-β)，被选择进行进一步的 RT-qPCR 分析。结果表明，水凝胶上雪旺细胞中MBP和其他基因的表达显着高于TCP组。HA和HASPy组中MBP的表达水平较高，因为MBP是早期髓鞘形成的重要标志物，表明水凝胶帮助雪旺细胞在轴突周围形成髓磷脂，进一步证明HA和HASPy水凝胶可能有益于髓鞘形成。

图5|水凝胶上雪旺细胞中相关基因和蛋白质的表达和功能验证

图6|转录组序列

为了探讨HASPy水凝胶对炎症的触发机制，选择CD44作为研究对象。HA可以与受体CD44相互作用，从而促进炎症。选择CD44进行qPCR分析。与TCP和HA组相比，HASPy组的CD44表达量最高，表明HASPy显着提高了雪旺细胞中CD44基因的水平。雪旺细胞在HASPy水凝胶上的生长增加了IL-17途径的表达；因此，选择IL-17RA来验证IL-17通路的高表达。结果显示，添加Ixekizumab后，HA和HASPy组IL-17RA水平显着低于TCP组，且CD44的表达水平也受到抑制，提示IL-17RA可能影响CD44。雪旺细胞功能相关基因(例如S100-β)的表达水平也受到抑制。

图7|验证HASPy与雪旺细胞之间的相互作用机制

图8|分子动力学(MD)模拟HASPy水凝胶与IL-17或IL-17受体的结合

【HASPy水凝胶对神经健康和功能的影响】

将HASPy水凝胶植入大鼠体内30天，以HA水凝胶和损伤组作为参考，以确定其对神经健康和功能的影响。损伤组和HA组分别恢复了原始功能的70.9±3.8%和73.6±6.2%，而HASPy治疗组的大鼠在30天内恢复了约87.5±1.8%的原始功能，表明HASPy组最接近正常功能。这表明HASPy水凝胶在挤压后可以最快地促进坐骨神经再生。

图9|坐骨神经用水凝胶修复30天

【小结】

总之，这里开发的水凝胶支架的最大优点是它模拟了体内环境，集可注射能力、自愈性、降解性、导电性和良好的机械性能以及生物相容性于一体，可以在分别是分子水平、细胞水平和动物水平。此外，还探讨了水凝胶对雪旺细胞协同作用的分子机制，并利用分子动力学模拟了HASPy与雪旺细胞之间的相互作用。这些发现对于研究可降解自修复导电水凝胶对神经再生的协同作用具有重要意义。尽管在初步评估中已经阐明了雪旺细胞的基因和蛋白表达，但还应该通过基因测序、抑制和分子生物学技术进一步阐明雪旺细胞的行为调节。而且，相应的敲除实验尚未得到验证。同时，雪旺细胞通路激活的内部机制仅得到部分探讨，还需要进一步的研究。此外，为了更好地评估所制备的水凝胶对神经再生的效果，必须验证体内实验的分子机制。最后，虽然 HASPy水凝胶促进了大鼠模型中的周围神经再生，但其在大型动物(例如兔子、狗和山羊)中枢神经系统神经再生中的作用应在未来得到验证。总体而言，本研究可能为周围神经再生人工植入物的开发提供重要的实验参考。

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