西安交通大学陈鑫/张彦民《AFM》: 智能纳米复合水凝胶，可用于治疗恶性黑色素瘤！

恶性黑色素瘤手术治疗后通常会出现肿瘤残留和组织损伤，而有效的术后治疗仍然是一个挑战，因为治疗需要同时操作肿瘤细胞和健康细胞。西安交通大学陈鑫&张彦民合作设计了MBGP-Gel，一种热敏且可生物降解的水凝胶，结合S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)负载和N-氨基乙基-N'-苯甲酰硫脲(BTU)修饰的MSN(MBGP NPs)，旨在利用肿瘤细胞和健康细胞之间铜含量的显着差异来调节各种生理微环境，用于肿瘤消除，转移抑制和组织再生的综合治疗。MBGP-Gel注射后在体温下发生溶胶-凝胶转化，并持续释放MBGP纳米颗粒。在肿瘤细胞中，这些纳米颗粒会螯合多余的铜以抑制肿瘤迁移。同时，铜被还原为亚铜，这进一步催化了丰富的H2O2和GSNO分别产生氧气(ROS)和一氧化氮(NO)。ROS及ROS和NO(ONOO)的反应产物会显着损害肿瘤组织。相比之下，进入健康细胞的MBGP纳米颗粒仅产生适量的NO以加速组织愈合。体外和体内结果表明，纳米复合水凝胶可抑制恶性黑色素瘤的生长和转移，促进皮肤再生，为各种肿瘤的术后治疗提供了有前景的策略。该研究以题为“Integration of Tumor Elimination And Tissue Regeneration via Selective Manipulation of Physiological Microenvironments Based on Intelligent Nanocomposite Hydrogel for Postoperative Treatment of Malignant Melanoma”的论文发表在《Advanced Functional Materials》上。

本文构建了N-氨基乙基-N'-苯甲酰硫脲(BTU，铜螯合剂)改性介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)，S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO，NO前体)负载在孔隙中。为了避免GSNO在进入靶细胞前过早泄漏，将纳米颗粒涂覆聚酯壳(PE)以生成最终的MSN-BTU-GSNO@PE纳米颗粒(MBGP NPs)，该纳米颗粒在内吞作用后只能通过酯酶降解以进行GSNO的细胞内释放。一旦MBGP进入肿瘤细胞，聚酯壳的降解就会暴露BTU以快速捕获肿瘤细胞中多余的铜，然后将它们还原为亚铜。生成的亚铜旨在与丰富的H2O2并在肿瘤细胞中释放GSNO以产生ROS和NO，从而有效操纵铜，ROS和NO以消除肿瘤。考虑到肿瘤治疗和组织再生对治疗时间的要求较长，将MBGP纳米颗粒进一步包封在由聚乳酸-乙醇酸-聚乙二醇-聚乳酸-共乙醇酸(PLGA-PEG-PLGA)形成的热敏可生物降解水凝胶中，通过水解不断分解，释放MBGP进行持续治疗(方案1)。

方案1. MBGP凝胶的合成和治疗机制示意图

【热敏复合水凝胶MBGP凝胶的制备与表征】

为制备MBGP-Gel水凝胶，首先通过BTU中氨基与环氧硅烷偶联剂改性MSNs(MSN-EO)中环氧基团的开环反应，合成了BTU改性MSN(MSN-BTU)。在对MSN-BTU进行表征后，加载S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO，NO前体)并使进一步涂覆聚酯壳以获得最终的MBGP纳米颗粒(MBGP NPs)。MBGP-凝胶的前体是通过将MBGP NPs与商品化的热敏PLGA-PEG-PLGA混合来制备的，后者如预期的那样在37°C的体温下进行溶胶-凝胶转变。

图1. MBGP凝胶的制备与表征

【MBGP凝胶的铜相关功能】

通过RhB的荧光光谱验证了MBGP NPs中GSNO的负载。计算出GSNO的最大上样量和包封效率分别为8.0%和54.7%。PLGA-PEG-PLGA水凝胶作为载体，在生理条件下可以实现负载纳米颗粒的长期释放，水凝胶具有良好的生物安全记录，在生理条件下可逐渐降解。且复合水凝胶载体MBGP-Gel可以保证MBGP NPs在体内长期高效释放。

充分利用肿瘤细胞中铜过多相对于正常细胞的微环境特性，研究了肿瘤细胞中MBGP NPs的铜捕获行为及其随后的化学动力学激活。结果表明，MBGP NPs在捕获过量Cu2+在肿瘤细胞中转化成Cu，可同时产生高浓度的NO和ROS，并进一步产生剧毒ONOO+−。同时，它起到了促进健康细胞生长和增殖的作用。

图2. MBGP凝胶的铜相关功能

【MBGP凝胶用于肿瘤治疗和组织再生的体外细胞选择性特性】

为了证明MBGP-Gel复合水凝胶在细胞水平上的治疗效果，首先通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和流式细胞术分析，在与人永生化表皮细胞(HacaT，作为正常细胞)和黑色素瘤细胞(B16F10，作为肿瘤细胞)共孵育后，研究了MBGP NPs的细胞摄取和保留。结果表明，MBGP纳米载体可以有效地递送到正常细胞和肿瘤细胞中，为进一步治疗提供了保证。

为了进一步了解这种肿瘤特异性趋化动力学疗法的机制，采用MBP-Gel(无GSNO负载的纳米复合水凝胶)作为对照。MBGP-Gel组的细胞内ROS水平显著升高，间接证实了Cu催化细胞内H+2O2生产 ROS。在MBGP-Gel组中，ROS和NO同时发布，ONOO−进一步产生，因此抗肿瘤效率进一步增强，导致治疗后<30%的肿瘤细胞存活病毒，而NO的缓慢释放促进了HacaT细胞的生长。

图3. MBGP凝胶用于肿瘤治疗

考虑到过量的铜会促进黑色素移瘤细胞的转，由于铜对肿瘤迁移/侵袭和血管形成的关键作用，MBGP-Gel进行的铜捕获有望阻止肿瘤转移。因此，通过划痕愈合测定和Transwell细胞侵袭测定法评估MBGP-Gel对B16F10细胞迁移和侵袭的影响。PBS和凝胶被用作对照组。相比之下，由于酰基硫脲在这些纳米颗粒上的铜捕获，MBP-Gel和MBGP-Gel组处理显着降低了B16F10细胞的迁移速度和迁移距离。此外，研究还发现MBP-Gel和MBGP-Gel通过有效抑制其上皮间充质转化过程，减少了肿瘤细胞的迁移和侵袭。

图4.组织再生的体外细胞选择性特性

【MBGP凝胶的体内抗肿瘤特性】

在通过铜捕获和铜依赖性催化药物治疗在细胞水平上证明了MBGP-Gel的协同抗肿瘤特性后，使用荷瘤(B16F10细胞同种移植肿瘤)裸鼠进一步研究了MBGP-Gel的体内治疗效果。结果表明，MBGP-Gel的治疗来源于BTU诱导肿瘤生理环境中铜操纵和铜触发催化医学治疗的双重治疗。还对这些获得的肿瘤组织进行了组织学分析发现MBGP-Gel治疗组的治疗效果最好，所有荷瘤小鼠在治疗后35 d存活，表明该策略可以通过铜捕获和铜依赖性催化药物治疗的协同作用有效延长荷瘤小鼠的生存期。

除原发性肿瘤外，转移性肿瘤是另一个关键的致死因素。因此，通过分析不同治疗后荷瘤小鼠的肺部，进一步评价MBGP-Gel的抗转移效果。发现MBP-Gel和MBGP-Gel处理的荷瘤小鼠在肺中没有可见的转移和肿瘤侵袭，表明MBGP-Gel在体内具有出色的抗转移能力。治疗后其他主要器官的组织学没有显着变化，表明联合治疗的副作用可以忽略不计。

图5. MBGP凝胶的体内抗肿瘤特性

【残余肿瘤切除与术后组织再生一体化治疗】

为验证术后肿瘤治疗和伤口愈合的综合效果，构建了不完全肿瘤切除模型。对照组肿瘤保持致密结构，癌细胞完整，MBP-Gel组肿瘤变小，MBGP-Gel组肿瘤完全消融，说明MBP-Gel和MBGP-Gel显著抑制肿瘤的再生长。在监测肿瘤复发的同时，还跟踪了伤口愈合的过程。MBGP-Gel可以在95天内闭合伤口并实现15%的伤口愈合。然而，与MBGP-Gel相比，MBP-Gel组的肿瘤仍表现出一定的生长，皮肤没有完全愈合，这与NO缺乏协同治疗有关。对肿瘤和皮肤组织进行组织学分析，进一步研究肿瘤伴随皮肤再生的抑制性复发。结果表明，MBGP-Gel组能有效杀灭残留的肿瘤细胞，抑制肿瘤复发，增强皮肤创面愈合。

图6. 肿瘤复发抑制及皮肤再生评价

【小结】

本研究利用两细胞铜含量的显著差异，制备了负载GSNO和BTU(铜螯合剂)修饰MSN(MBGP NPs)的热敏可生物降解水凝胶MBGP-Gel，以调控肿瘤细胞和健康细胞中的铜含量、ROS含量和NO含量，从而实现肿瘤切除的一体化治疗，转移抑制和组织再生。凝胶分解释放的MBGP NPs已被证明通过增强的通透性和内吞作用在肿瘤和正常细胞中大量积累。MBGP NPs进入肿瘤细胞会掠夺过量的铜离子，实现铜还原治疗，从而有效抑制肿瘤转移。同时，螯合铜同时还原为亚铜，进一步催化过量的H2O2在肿瘤细胞中产生高细胞毒性的ROS，催化释放GSNO产生NO。随后，ROS和NO协同生产出剧毒ONOO−原位，从而产生额外的铜触发化学动力学治疗。此外，MBGP NPs进入正常细胞，酯酶降解后去除外壳，释放负载的GSNO，缓慢分解产生可忽略不计的ROS和适当浓度的NO，具有促进健康细胞增殖，加速荷瘤小鼠组织愈合的功能。通过肿瘤细胞与健康细胞微环境的显著差异，这种一体化治疗策略不仅实现了亚铜催化破坏原发肿瘤的ROS和NO协同治疗，而且通过铜掠夺控制肿瘤细胞中铜的浓度抑制肿瘤转移，同步实现了NO在促进皮肤再生方面更为重要的功能，有助于理解和应用智能纳米材料在肿瘤术后残余肿瘤切除和组织再生的综合治疗中的应用。

封面来源于图虫创意